Przegląd badań laboratoryjnych dostępnych w diagnostyce COVID-19

Badania aktualnie stosowane w diagnostyce COVID-19 można podzielić na 3 grupy:

1. Wykrywanie obecności materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 w wymazie z dróg oddechowych za pomocą metody real time RT-PCR (badanie molekularne).
2. Wykrywanie obecności antygenów białkowych wirusa SARS-CoV-2 w wymazie z dróg oddechowych za pomocą testów antygenowych (testy antygenowe).
3. Oznaczanie stężenia przeciwciał anty-SARS-CoV-2 w prób­ce krwi żylnej (badanie serologiczne).

Badanie molekularne (metoda real time RT-PCR) wymazu z dróg oddechowych jest rekomendowane przez WHO[1] i uzna­wane powszechnie za „złoty standard” do rozpoznawania infekcji wirusem SARS-CoV-2. Metodyka RT-PCR jest stosowana z powo­dzeniem w diagnostyce medycznej od lat, a szczególnie właśnie przy diagnozowaniu infekcji wirusowych (np. wirusowe zapalenia wątroby, grypa). Stąd też przystosowanie się działających labo­ratoriów biologii molekularnej do wykrywania nowego patogenu nie zajęło wiele czasu, a dodatkowo powstało wiele nowych jed­nostek. W efekcie tego w Polsce działa około 250 laboratoriów[2] wykonujących badania RT-PCR wykrywające obecność wirusa SARS-CoV-2, a liczba laboratoriów działających na świecie jest liczona w dziesiątkach tysięcy.

Laboratoria wykorzystują metody RT-PCR wykrywające co naj­mniej dwa fragmenty genomu SARS-CoV-2, a dostępne są także metody trój- i czterogenowe. Taka metodyka pociąga za sobą ści­śle określony sposób przedstawiania wyników: wynik pozytywny oznacza wykrycie co najmniej dwóch genów wirusa, wynik nega­tywny nie wykrycie żadnego, a wynik nierozstrzygający wykrycie jednego genu (takie badanie należy jak najszybciej wykonać po­nownie z nowo pobranego materiału). Wynik może być także wy­rażany jako niediagnostyczny w przypadku, kiedy nie jest możliwe prawidłowe wykonanie badania np. z powodu niespecyficznych inhibitorów reakcji obecnych w badanym materiale. Pozytywny wynik badania pojawia się zazwyczaj już w 5-7 dniu od zakażenia. Uzyskanie dodatniego wyniku badania, szczególnie przy wystę­powaniu objawów klinicznych infekcji, jednoznacznie potwierdza rozpoznanie COVID-19. Pozytywny wynik badania molekularnego obserwuje się przez okres trwania objawów klinicznych i jeszcze kilka-kilkanaście dni później, ale w niektórych przypadkach może on utrzymywać się u ozdrowieńców nawet do 3 miesięcy po wy­zdrowieniu. Dlatego też badanie molekularne nie jest wyznacz­nikiem ozdrowienia i braku zakaźności i jego pozytywny wynik u ozdrowieńca nie świadczy o tym, że jest on wciąż chory i zakaź­ny[3]. Z tego wynika też wniosek, że pozytywny wynik badania mo­lekularnego uzyskany u pacjenta bez objawów klinicznych może świadczyć o bezobjawowym przebiegu infekcji, ale może być tak­że konsekwencją infekcji przebytej bezobjawowo lub  skąpoobja­wowo w okresie ostatnich dni lub tygodni. Niezależnie od tego, ze względu na bezpieczeństwo epidemiczne, każdy pierwszorazowy pozytywny wynik badania molekularnego uzyskany przez danego pacjenta skutkuje nałożeniem na niego kwarantanny. Negatywny wynik badania molekularnego uzyskany u osoby bez objawów kli­nicznych w praktyce potwierdza brak infekcji w momencie bada­nia. Natomiast pojedynczy ujemny wynik badania molekularnego uzyskany u osób z objawami klinicznymi nie wyklucza zakażenia i nie może być traktowany jako jedyne kryterium diagnostyczne. W niektórych przypadkach, jeżeli objawy kliniczne utrzymują się, powinno podjąć się decyzję o powtórnym wykonaniu badania molekularnego[3].

Niezmiernie ważnym problemem przy badaniu wymazów z dróg oddechowych jest prawidłowe pobranie materiału i jego zabez­pieczenie. Metodą z wyboru przy pobraniu jest wymaz z noso­gardzieli (ewentualnie „wzmocniony” przez dodatkowy wymaz z nozdrzy)[4]. Natomiast stabilność materiału po pobraniu można zapewnić poprzez stosowanie specyficznych podłoży/zestawów do pobrania, które inaktywują wirusa obecnego w pobranym materiale i stabilizują jego materiał genetyczny. Przy pobieraniu materiału bez stosowania podłoży/zestawów stabilizujących klu­czowe jest jak najszybsze dostarczenie materiału do laboratorium i rozpoczęcie procedowania próbki (maksymalnie kilka godzin). Niestety dłuższe przetrzymanie próbki przed badaniem może skutkować degradacją materiału genetycznego wirusa i uzyska­niem wyniku fałszywie negatywnego.

Oprócz klasycznej metody RT-PCR do diagnostyki COVID-19 wykorzystywane są szybkie testy molekularne dostępne na kilku platformach analitycznych (np. Roche LIAT, Cepheid GenXpert). Ich ogromną zaletą jest możliwość uzyskania wyniku badania już po kilkudziesięciu minutach, a wadą brak gwarancji zapewnie­nia ciągłości dostaw odczynnikowych przez producentów, co nie dziwi, gdyż technologia ta jest pożądana obecnie na całym świe­cie. W związku z tym działające w Polsce analizatory wykonujące szybkie testy molekularne muszą być traktowane jako narzędzie wykorzystywane do specjalnych zastosowań (najczęściej wspie­rające szpitalne SORy) i stanowią one jedynie dodatek do diagno­styki realizowanej za pomocą klasycznej metodyki RT-PCR.

Wymazowe testy antygenowe zostały wprowadzone do szero­kiego użytkowania w ostatnich tygodniach i traktowane są jako narzędzie wspierające do diagnostyki COVID-19. Ich zaletą jest szybkie uzyskanie wyniku, stosunkowo niski koszt i wysoka swo­istość. Oznacza to, że pozytywny wynik uzyskany za pomocą te­stu antygenowego potwierdza infekcję SARS-CoV-2. Dlatego też Ministerstwo Zdrowia dodało uzyskanie dodatniego wyniku testu antygenowego do kryteriów rozpoznania COVID-19[3] i osoby, któ­re uzyskały taki wynik są kierowane na kwarantannę. Niestety testy antygenowe charakteryzują się niższą, w stosunku do ba­dań molekularnych, czułością (pomiędzy 80% a 90%), co oznacza, że wynik negatywny nie jest podstawą do wykluczenia infekcji, a szczególnie w przypadku, gdy występują jednocześnie objawy kliniczne. W takich przypadkach wskazana jest weryfikacja i wy­konanie uznanego za referencyjne badania molekularnego. Testy antygenowe są pozytywne w okresie aktywnej infekcji, a wynik tego badania jest zawsze negatywny u ozdrowieńców. Dlatego też coraz większa grupa ekspertów proponuje wykorzystanie testów antygenowych do potwierdzania zakaźności pacjenta, gdyż każdy pacjent z dodatnim wynikiem testu antygenowego jest zakaźny. Stąd też koncepcja badania osób po przebytej infekcji w celu upewnienia się, że nie stanowią oni zagrożenia epidemicznego, gdyż uzyskanie wyniku negatywnego testu przy braku występo­wania objawów klinicznych infekcji praktycznie wyklucza taką możliwość. Oczywiście, w związku z niewystarczającą wartością predykcyjną ujemną, ujemny wynik testu nie może być traktowa­ny jako pewne potwierdzenie braku zakaźności.

Testy antygenowe dostępne są jako szybkie testy kasetkowe (jakościowe) oraz ilościowe badania wykonywane przez auto­matyczne analizatory immunochemiczne. Pierwsze rozwiąza­nie może być wykorzystane w laboratoriach oraz w trybie POCT (ang. point-of-care testing) tzn. w miejscu opieki nad pacjentem np. na Szpitalnym Oddziale Ratunkowym. Zaletą szybkich testów kasetkowych jest krótki czas potrzebny dla uzyskania wyniku, a wadą subiektywizm odczytu wyniku przez oko ludzkie i jako­ściowa forma wyniku (pozytywny/negatywny). Bardziej wiary­godnym z tego punktu widzenia rozwiązaniem jest automatyczne ilościowe oznaczanie antygenów, które gwarantuje obiektywne wyrażenie wyniku w sposób ilościowy, a cały proces laboratoryjny jest ściśle kontrolowany, jednak wymaga to kilku godzin czasu. Dodatkowym wyzwaniem jest konieczność zapewnienia odpo­wiedniej jakości i wiarygodności testów wykonywanych w trybie POCT. W związku z tym Krajowa Rada Diagnostów Laboratoryj­nych w stanowisku z 17.11.2020 r.[5] wskazała konieczność uczest­nictwa medycznego laboratorium diagnostycznego w koordyna­cji procesu badań POCT, przywołała wymagania zdefiniowane dla procesu POCT, a zawarte w normie PN-EN 22870:2017[6] oraz poruszyła problemy związane z prowadzeniem dokumentacji me­dycznej w procesie POCT i raportowaniem uzyskanych wyników. Czas pokaże jak będzie zorganizowane wykonywanie wymazo­wych testów antygenowych w Polsce w najbliższych miesiącach.

Warto wspomnieć o kryteriach jakościowych jakie muszą spełnić stosowane wymazowe testy antygenowe. Zgodnie z wytyczny­mi WHO testy te muszą charakteryzować się co najmniej 97% swoistością i 80% czułością (obie wartości uzyskane u pacjentów objawowych)[7] i najlepiej, gdyby te wartości zostały potwierdzone w niezależnych badaniach eksperckich. Kryteria te spełnia kilka dostępnych na rynku testów, a zapewne niebawem pojawią się kolejne.

Wymazowe testy antygenowe zostały wprowadzone do szero­kiego użytkowania w ostatnich tygodniach i traktowane są jako narzędzie wspierające do diagnostyki COVID-19. Ich zaletą jest szybkie uzyskanie wyniku, stosunkowo niski koszt i wysoka swo­istość. Oznacza to, że pozytywny wynik uzyskany za pomocą te­stu antygenowego potwierdza infekcję SARS-CoV-2. Dlatego też Ministerstwo Zdrowia dodało uzyskanie dodatniego wyniku testu antygenowego do kryteriów rozpoznania COVID-19[3] i osoby, któ­re uzyskały taki wynik są kierowane na kwarantannę. Niestety testy antygenowe charakteryzują się niższą, w stosunku do ba­dań molekularnych, czułością (pomiędzy 80% a 90%), co oznacza, że wynik negatywny nie jest podstawą do wykluczenia infekcji, a szczególnie w przypadku, gdy występują jednocześnie objawy kliniczne. W takich przypadkach wskazana jest weryfikacja i wy­konanie uznanego za referencyjne badania molekularnego. Testy antygenowe są pozytywne w okresie aktywnej infekcji, a wynik tego badania jest zawsze negatywny u ozdrowieńców. Dlatego też coraz większa grupa ekspertów proponuje wykorzystanie testów antygenowych do potwierdzania zakaźności pacjenta, gdyż każdy pacjent z dodatnim wynikiem testu antygenowego jest zakaźny. Stąd też koncepcja badania osób po przebytej infekcji w celu upewnienia się, że nie stanowią oni zagrożenia epidemicznego, gdyż uzyskanie wyniku negatywnego testu przy braku występo­wania objawów klinicznych infekcji praktycznie wyklucza taką możliwość. Oczywiście, w związku z niewystarczającą wartością predykcyjną ujemną, ujemny wynik testu nie może być traktowa­ny jako pewne potwierdzenie braku zakaźności.

Testy antygenowe dostępne są jako szybkie testy kasetkowe (jakościowe) oraz ilościowe badania wykonywane przez auto­matyczne analizatory immunochemiczne. Pierwsze rozwiąza­nie może być wykorzystane w laboratoriach oraz w trybie POCT (ang. point-of-care testing) tzn. w miejscu opieki nad pacjentem np. na Szpitalnym Oddziale Ratunkowym. Zaletą szybkich testów kasetkowych jest krótki czas potrzebny dla uzyskania wyniku, a wadą subiektywizm odczytu wyniku przez oko ludzkie i jako­ściowa forma wyniku (pozytywny/negatywny). Bardziej wiary­godnym z tego punktu widzenia rozwiązaniem jest automatyczne ilościowe oznaczanie antygenów, które gwarantuje obiektywne wyrażenie wyniku w sposób ilościowy, a cały proces laboratoryjny jest ściśle kontrolowany, jednak wymaga to kilku godzin czasu. Dodatkowym wyzwaniem jest konieczność zapewnienia odpo­wiedniej jakości i wiarygodności testów wykonywanych w trybie POCT. W związku z tym Krajowa Rada Diagnostów Laboratoryj­nych w stanowisku z 17.11.2020 r.[5] wskazała konieczność uczest­nictwa medycznego laboratorium diagnostycznego w koordyna­cji procesu badań POCT, przywołała wymagania zdefiniowane dla procesu POCT, a zawarte w normie PN-EN 22870:2017[6] oraz poruszyła problemy związane z prowadzeniem dokumentacji me­dycznej w procesie POCT i raportowaniem uzyskanych wyników. Czas pokaże jak będzie zorganizowane wykonywanie wymazo­wych testów antygenowych w Polsce w najbliższych miesiącach.

Warto wspomnieć o kryteriach jakościowych jakie muszą spełnić stosowane wymazowe testy antygenowe. Zgodnie z wytyczny­mi WHO testy te muszą charakteryzować się co najmniej 97% swoistością i 80% czułością (obie wartości uzyskane u pacjentów objawowych)[7] i najlepiej, gdyby te wartości zostały potwierdzone w niezależnych badaniach eksperckich. Kryteria te spełnia kilka dostępnych na rynku testów, a zapewne niebawem pojawią się kolejne.

W praktyce stosowane są dwie strategie badania.

Pierwsza proponuje oznaczanie przeciwciał w dwóch klasach: IgM (lub alternatywnie IgA) i IgG. Obecność przeciwciał „fazy ostrej” IgM (lub IgA) może świadczyć o wczesnej fazie zdrowie­nia lub nawet jeszcze aktywnej chorobie, gdyż te przeciwciała są produkowane jako pierwsze już w drugim tygodniu od zainfe­kowania. Obecność przeciwciał „fazy przewlekłej” IgG świadczy raczej o późniejszym okresie zdrowienia lub nawet o przebyciu choroby przed tygodniami, a nawet miesiącami. To właśnie ta klasa przeciwciał w dużej mierze determinuje nabytą odporność na ponowną infekcję. W praktyce osoby, u których wykrywa się przeciwciała IgM (przy braku lub w obecności przeciwciał IgG) powinny zostać zweryfikowane za pomocą badań wymazowych, aby wykluczyć aktywną infekcję, natomiast osoby z obecnymi je­dynie przeciwciałami IgG najpewniej przeszły infekcję i są odpor­ne (przynajmniej na jakiś czas) na ponowne zakażenie. Ważną zasadą jest nie badanie obu klas przeciwciał IgM (lub IgA) i IgG, ewentualnie tylko klasy IgG (przy ocenie kontaktu lub choroby przebytej przed co najmniej kilkoma tygodniami). Nie jest zasadne wykonywanie badania przeciwciał jednie w klasie IgM (lub IgA)[8], gdyż wynik dodatni IgM (lub IgA), przy braku wyniku dla klasy IgG, uniemożliwia prawidłową interpretację kliniczną przypadku.

Druga strategia badań to oznaczanie przeciwciał całkowitych, bez podziału na klasy. Badanie przeciwciał całkowitych zapew­nia wyższą swoistość niż badanie przeciwciał w dwóch klasach. U pewnego odsetka pacjentów, szczególnie tych z innymi infek­cjami lub chorobami autoimmunologicznymi, obserwować można reakcje krzyżowe powodujące uzyskanie fałszywie pozytywnego wyniku badania, szczególnie w klasie IgM (lub IgA). W przypadku oznaczania przeciwciał całkowitych takie próbki dają zazwyczaj wynik ujemny, podczas gdy wszystkie próbki z obecnymi prze­ciwciałami IgG dają wynik dodatni. To powoduje, że przeciwciała całkowite anty-SARS-CoV-2 stanowią ciekawą alternatywę dla oznaczania przeciwciał w dwóch klasach, szczególnie przy ocenie nabycia odporności i wykrywaniu pacjentów, którzy bezobjawowo przeszli infekcję.

Rola badań serologicznych w COVID-19 bez wątpienia wzro­śnie wraz z rozpoczęciem planowanych na globalną skalę szczepień. Oznaczanie stężenia przeciwciał jest bowiem natu­ralnym sposobem oceny skuteczności szczepienia, które musi doprowadzić do pojawienia się przeciwciał odpornościowych anty-SARS-CoV-2. Wtedy też zapewne będziemy mogli porów­nać między sobą poszczególne dostępne metody oznaczania przeciwciał anty-SARS-CoV-2 na dużej liczbie przypadków, a być może uda się także zdefiniować pożądaną po szczepieniu wartość stężenia przeciwciał będącą potwierdzeniem nabycia odporności.

Dr n. med. Tomasz Anyszek

Pełnomocnik Zarządu ds. Medycyny Laboratoryjnej Diagnostyka sp. z o.o.

Artykuł ukazał się w 76. numerze LabForum

Piśmiennictwo:

1. „Laboratory testing for coronavirus disease (COVID-19) in suspected humans cases”. Interim Guidance, 19 March 2020. World Health Organization.
2. Lista lab COVID prowadzona przez Ministerstwo Zdrowia. https://www.gov.pl/web/zdrowie/ lista-laboratoriow-covid
3. Stanowisko Zespołu do spraw koordynacji sieci laboratoriów COVID w sprawie możliwości wykorzystania testów wykrywających antygen SARS-CoV-2 w diagnostyce COVID-19 w Pol­sce z dnia 03 listopada 2020 r.
4. Zasady pobierania i transportu materiału do badań metodami molekularnymi RT PCR w kierunku SARS-CoV-2 wg Konsultanta Krajowego w dziedzinie mikrobiologii lekarskiej, Prof. Katarzyna Dzierżanowska-Fangrat oraz zespołu konsultanci wojewódzcy w dziedzinie mikrobiologii lekarskiej: Tomasz Ozorowski, Krzysztof Burdynowski, Alina Olender, Bonita Durnaś, Gajane Martirosjan, Anetta Bartczak, Marzenna Bartoszewicz, Małgorzata Bulan­da, Piotr Wieczorek, Aleksander Deptuła, Joanna Jursa-Kulesza, Jadwiga Ślusarska-Kopala, Ewa Augustynowicz-Kopeć oraz Anna Mól, Beata Kasztelewicz. 14 kwietnia 2020 r.
5. Stanowisko KRDL z dnia 17 listopada 2020 r. odnośnie wykonywania badań szybkimi testami antygenowymi u pacjentów z podejrzeniem zakażenia SARS-CoV-2.
6. PN-EN ISO 22870:2018-02 „Badania w miejscu opieki nad pacjentem – wymagania doty­czące jakości i kompetencji.”
7. „Antigen-detection in the diagnosis of SARS-CoV-2 infection using rapid immunoassays.” Interim Guidance, 11 September 2020. World Health Organization.
8. Przydatność badań serologicznych przeciwko SARS-CoV-2 z punktu widzenia zdrowia publicznego – Zalecenia Polskiego Stowarzyszenia Naukowego „Zagrożenia Cywilizacyjne i Zdrowie Publiczne„ 21 sierpnia 2020 r.