Diagnostyka molekularna alergii

Przeciwciała klasy IgE uczestniczą w mechanizmie anafilaktycznej reakcji alergicznej określanej jako natychmiastowa reakcja nadwrażliwości typu I (zależnej od IgE). Osoby uczulone przez obcy antygen, zwany alergenem, posiadają we krwi wykrywalne stężenie IgE swoistych dla tego alergenu (w skrócie: asIgE lub sIgE), efektora tego rodzaju nadwrażliwości. U osób zdrowych sIgE o takiej swoistości są niewykrywalne. Uczulenie objawowe, w którym pośredniczy sIgE określane jest jako alergia zależna od IgE. U osób uczulonych, obecne w miejscu wniknięcia alergenu, preformowane,  sIgE generują po kontakcie z alergenem miejscowy stan zapalny oraz wpływają na nasilenie syntezy kolejnych frakcji sIgE.  W efekcie dochodzi do wzmocnienia i uogólnia IgE-zależnej reakcji alergicznej. Nasilenie reakcji koreluje dodatnio ze stężeniem sIgE rozpoznających białkowe struktury alergenów, natomiast IgE rozpoznające uniwersalne, gatunkowo nieswoiste, determinanty cukrowe, CCD (ang. Cross-reactive Carbohydrate Determinants) alergenów glikoproteinowych, czyli  IgE anty-CCD – są nieme klinicznie. Laboratoryjny pomiar stężenia asIgE we krwi jest badaniem komplementarnym do ambulatoryjnych alergologicznych testów skórnych (SPT), jednakże, w przeciwieństwie do testów skórnych i prowokacji alergenowych, jest zupełnie bezpieczny dla badanego.

Skokowa zmiana w pozycjonowaniu pomiarów stężenia asIgE w diagnostyce chorób alergicznych nastąpiła w momencie narodzin diagnostyki molekularnej alergii (ang. molecular allergology). W diagnostyce molekularnej alergen definiowany jest jako immunogenne białko o znanej: strukturze fizycznej (kłębek statystyczny, dimer, globulina etc.); funkcji biochemicznej (np. enzym) czy funkcji fizjologicznej (np. roślinne białko spichrzowe). Alergeny molekularne oznaczane są zgodnie z unifikowaną nomenklaturą WHO/IUIS. Pierwszy człon stanowią trzy pierwsze litery łacińskiej nazwy systematycznej źródła alergenu (ang. allergen source), drugi pierwsza litera nazwy gatunkowej, a trzeci liczba porządkowa alergenu danego źródła. Przykładowo, alergen główny pyłku brzozy: Betula verrucosa, opisany jest symbolem Bet v 1.

Diagnostyczne alergeny molekularne uzyskiwane są przez biochemiczną ekstrakcję  źródła alergenów (np. pyłku roślinnego czy jadu owadów) lub na drodze inżynierii genetycznej, przy użyciu rekombinowanych systemów ekspresyjnych (bakterii lub drożdży). Pierwsze określane są jako alergeny wysokooczyszczone, a ich symbol WHO/IUIS poprzedzony jest literą n (natywne), drugie noszą nazwę alergenów rekombinowanych, z symbolem poprzedzonym literą r (rekombinowane). Stosowane wyłącznie w testach in vitro alergeny rekombinowane są modyfikowane dla poprawy czułości oznaczenia bez utraty swoistości. Modyfikacje dotyczą redukcji reszt cukrowych CCD alergenów glikoproteinowych. Skrócenie łańcuchów CCD minimalizuje wpływ wiążących je, nieistotnych klinicznie, IgE-anty CCD na wynik pomiaru istotnych diagnostycznie i klinicznie asIgE rozpoznających fragmenty peptydowe glikoprotein.

Molekularna diagnostyka alergii, określana również jako diagnostyka oparta na komponentach, CRD (ang. component resolved diagnostics), selektywnie wskazuje tylko te alergeny molekularne, które są odpowiedzialne za uczulenie, czyli generują istotne klinicznie asIgE. Fragment alergenu molekularnego rozpoznawany przez paratop, miejsce wiążące sIgE, określany jest jako epitop. Epitopem może być krótka sekwencja aminokwasów, określana jako  epitop liniowy lub aminokwasy z sąsiednich łańcuchów trójwymiarowej struktury białka, łącznie tworzących epitop określany jako epiotop przestrzenny. Epitopy liniowe wykazują odporność na denaturację cieplną i na działanie enzymów proteolitycznych, podczas gdy epitopy przestrzenne są termowrażliwe i ulegają proteolizie. Właściwości epitopów decydują o wpływie czynników fizycznych i chemicznych na immunogenność alergenu. Niekiedy, pod wpływem ogrzewania lub działania proteaz, epitopy przestrzenne mogą przekształcać się tworząc tzw. neodeterminanty, czyli epitopy rozpoznawane przez odrębną frakcję sIgE. CCD alergenów glikoproteinowych wiążące przeciwciała IgE anty-CCD określane są jako glikotopy.

Wykrycie IgE swoistych dla alergenu molekularnego o znanej immunogenności, wrażliwości na enzymy proteolityczne i temperaturę i fenotypie klinicznym uczulenia (objawy, stopień uogólnienia reakcji), pozwala na:

• określenie rodzaju uczulenia: uczulenie pierwotne, monouczulenie lub współuczulenie); kliniczna krzyżowa reaktywność;
• wnioskowanie o nasileniu i charakterze reakcji alergicznych (miejscowe, układowe, uogólnione, uogólnione zagrażające życiu);
• ustalenie metod ograniczania potencjału uczulającego (np. obróbka cieplna źródła alergenu)
• ocenę zasadności alergenowo-swoistej immunoterapii.

Identyfikacja gatunkowo-swoistego alergenu molekularnego jako przyczyny alergii pozwala na pominięcie prowokacji alergenowej jako testu weryfikującego poprawność rozpoznania. Możliwości, których dostarczyła diagnostyka molekularna pozwoliły na zmianę paradygmatu diagnostyki alergii. Dotychczasowy, klasyczny algorytm diagnostyczny: Top-down (z góry na dół), ukierunkowywał dobór pojedynczych alergenów do testów diagnostycznych (in vivo i in vitro) w oparciu o wywiad kliniczny. W proponowanym, określanym jako Bottom-up (z dołu do góry), historia choroby analizowana jest ex post w oparciu o identyfikację profilu asIgE dla możliwie najszerszego zestaw alergenów molekularnych o znanym potencjale uczulającym i fenotypie alergii.

Zestawienie algorytmów diagnostyki alergologicznej: klasycznego Top down i proponowanego Bottom up wykorzystującego możliwości stworzone przez molekularne testy multiplexowe: Alex2 i Alex3. Wg. Molecular allergology, Users’s guide, 2016, zmienione.

Zgodnie z dotychczasową strategią diagnostyczną zalecaną m.in. przez Instytut Norm Klinicznych i Laboratoryjnych, CLSI (ang. Clinical and Laboratory Standard Institute) i zgodną z rekomendacjami polskimi, pełny diagnostyczny algorytm chorób alergicznych obejmuje: badania fizykalne; komplementarne testy diagnostyczne identyfikujące asIgE: in vivo (SPT) i in vitro (pomiar stężenia); testy funkcjonale in vitro (np. test aktywacji bazofilów, BAT, ang. basophil activation test); niekiedy rozstrzygające testy ekspozycyjne (prowokacje). W wywiadzie, uważanym za punkt wyjścia i swoistą mapę drogową („Clinical history drives the diagnosis” – wywiad ukierunkowuje diagnozę), typowane są alergeny uczulające, a trafność wyboru potwierdzana jest przez identyfikację swoistych dla nich IgE. Algorytm taki – Top-down – obdarzony jest sporą przypadkowością, i nawet mimo doświadczenia lekarza, sprowadza się często do metody prób i błędów, co znacznie  wydłuża proces diagnozy i opóźnia wdrożenie właściwego leczenia i profilaktyki. W algorytmie Bottom-up obraz alergii pacjenta konfrontowany jest z hipotetycznym obrazem klinicznym wynikającym ze zidentyfikowanego profilu sIgE. Przy odpowiednio szerokim zestawie analizowanych alergenów molekularnych prawidłowe dopasowanie obrazu klinicznego alergii możliwe jest na pierwszym spotkaniu z alergologiem (o ile pacjent wykona badanie przed wizytą).

Unikalne możliwości diagnostyki molekularnej dopuszczają postępowania diagnostyczne oparte wyłącznie na badaniach in vitro, co jest szczególnie istotne dla lekarzy specjalności innej niż alergologia, pozbawionych zaplecza ambulatoryjnego, a stających przed koniecznością różnicowania alergicznej etiologii objawów u swoich pacjentów.

Najobszerniejszym, zaawansowanym testem  do molekularnej diagnostyki alergii IgE-zależnej jest multiplex Alex3, umożliwiający równoczesny pomiar stężenia sIgE dla 300 alergenów: 82 ekstraktów źródeł alergenów, ich 218 istotnych diagnostycznie i klinicznie alergenów molekularnych oraz pomiar stężenia IgE całkowitej w zakresie 2-1000 kU/l. Pomiar sIgE wykonywany jest w surowicy po zablokowaniu przeciwciał IgE anty-CCD.

Piśmiennictwo:

1. Molecular Allergology User’s Guide 2.0. Editors: K.Hoffmann-Sommergruber, Ch. Hilger, A. Santos, L.de las Vecillas, S. Dramburg, Published by the European Academy of Allergy and Clinical Immunology, 2022.